酒是伴随人(rén)類最久的加工(gōng)飲品之一(yī)，主要(yào)由植物(wù)發酵制成。飲酒文化與人(rén)類共同發展，被廣泛用于社交活動、飲食、食物(wù)保存和(hé)烹饪過程等。一(yī)般來說，飲酒以後會産生抑制中樞神經系統的作(zuò)用，并随着喝(hē)酒量的增加，機體會産生愉悅、放松或步态紊亂等行(xíng)為(wèi)。但(dàn)是，不健康的飲酒行(xíng)為(wèi)包括從(cóng)難以自(zì)控的暴飲到酒精成瘾不僅能(néng)造成不良的個人(rén)健康和(hé)安全後果還會帶來嚴重的經濟與社會問(wèn)題 1,2。據統計，全世界每年(nián)有近三億人(rén)有這(zhè)樣的酒精使用障礙症狀 (alcohol use disorder, AUD)。然而，當前對酒精使用障礙的形成機制所知有限，另外(wài)也缺乏有效的治療方案與藥物(wù)。另據世界衛生組織報道(dào)，截止 2019 年(nián)為(wèi)止，全世界每年(nián)約有 260 萬人(rén)死于飲酒。在中國(guó)，據統計人(rén)均酒精使用量從(cóng) 2005 年(nián)的 4.1 升增加到 2016 年(nián)的 7.2 升，增幅有 76% 之巨 1。這(zhè)說明(míng)與酒精相關的健康與社會問(wèn)題在中國(guó)有變嚴重的趨勢。在生理水平上(shàng)，已有研究表明(míng)酒精能(néng)通(tōng)過調節多種離子通(tōng)道(dào)和(hé)受體的活性來調控大腦中的抑制性神經元和(hé)興奮性神經元的激活，進而影響行(xíng)為(wèi)。另外(wài)，也有研究顯示酒精可(kě)以調節多巴胺的釋放，引起飲酒後的愉悅感 2-4。然而，盡管過去幾十年(nián)已經取得很(hěn)多進展，目前關于酒精如(rú)何在分子水平上(shàng)靶向大腦神經元進而來調節飲酒相關的行(xíng)為(wèi)的機制仍不清楚。
近年(nián)來，美國(guó)國(guó)立衛生研究院國(guó)家神經疾病與中風(fēng)研究所（NINDS）陸偉課題組一(yī)直在研究谷氨酸能(néng)興奮性和(hé) γ-氨基丁酸（GABA）能(néng)抑制性神經元的生理功能(néng)。課題組前期發現，膜蛋白 GSG1L 負向調節 α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（AMPA 受體）介導的突觸傳遞，比如(rú) GSG1L 的過表達會抑制 AMPA 受體介導的突觸傳遞，反之則會增強 AMPA 受體介導的突觸傳遞 5。另外(wài)，在小鼠願意付出更多的努力來獲得更好的食物(wù)這(zhè)一(yī)行(xíng)為(wèi)的研究中，課題組發現谷氨酸能(néng)傳遞到多巴胺能(néng)神經元的突觸傳遞在獎賞動機行(xíng)為(wèi)中起到關鍵作(zuò)用 6。在課題組主要(yào)研究方向，也就是研究抑制能(néng)突觸的發育與功能(néng)方面，該團隊首先證實了(le) N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA 受體）在 GABA 能(néng)突觸的發育中起到關鍵的作(zuò)用，并進一(yī)步闡述了(le)抑制性突觸蛋白 Neuroligin 2 和(hé) Slitrk3 如(rú)何在分子水平上(shàng)相互作(zuò)用調節 GABA 能(néng)突觸的發育，并進而提出了(le) GABA 能(néng)突觸發育的基本理論框架 7。該課題組在最近的工(gōng)作(zuò)發現了(le)慢(màn)性壓力能(néng)增強 Src 激酶的活性以及鈣調蛋白的酪氨酸磷酸化，進而削弱了(le) MyosinVa（MyoVa）與 Neuroligin2（NL2）的相互作(zuò)用，導緻抑制性突觸傳遞的減少(shǎo)并引發更強的焦慮樣行(xíng)為(wèi) 8。在 GABAA 受體研究方面，其實驗室發現 GABAA 受體的第一(yī)個能(néng)調控受體的動力學和(hé)藥理學的輔助亞基，也就是單跨膜蛋白 Shisa79。實驗室随後的一(yī)系列的工(gōng)作(zuò)表明(míng) Shisa7 是能(néng)控制苯二氮卓類藥物(wù)作(zuò)用于 GABAA 受體并調節其降焦慮和(hé)麻醉效應的關鍵亞基 9。另外(wài)，Shisa7 還能(néng)調控 tonic 抑制電流，加快(kuài) GABAA 受體的關閉并降低(dī)受體單通(tōng)道(dào)激活的頻(pín)率 10-12。
2024 年(nián) 10 月 01 日, Cell 雜(zá)志在線發表了(le)陸偉課題組的最新研究論文, 題為(wèi)「The TMEM132B-GABAA receptor complex controls alcohol actions in the brain」( TMEM132B-GABAA 受體複合物(wù)調控酒精在大腦中的作(zuò)用) 的研究論文。該研究發現一(yī)個新的單跨膜蛋白 TMEM132B，其能(néng)結合 GABAA 受體并增強酒精對 GABAA 受體的正變構效應，進而調節和(hé)酒精相關的行(xíng)為(wèi)。這(zhè)項研究進一(yī)步豐富了(le)該團隊對于 GABAA 受體的系列開(kāi)創性研究，為(wèi)酒精行(xíng)為(wèi)效應的分子機制提供了(le)新的視(shì)角，并為(wèi)臨床治療酒精成瘾以及新藥研發提供了(le)可(kě)能(néng)的理論指導。
探尋大腦中與酗酒相關的蛋白
酒精在動物(wù)身上(shàng)能(néng)引起很(hěn)多行(xíng)為(wèi)反應，但(dàn)其分子機制并不清楚。以前的研究發現酒精能(néng)結合大腦中的很(hěn)多膜蛋白，包括多種離子通(tōng)道(dào)和(hé)受體（這(zhè)其中也包括 GABAA 受體），并改變它們的活性，進而改變神經元活性并引起行(xíng)為(wèi)變化。但(dàn)在分子細胞和(hé)系統行(xíng)為(wèi)水平上(shàng)，具體的酒精靶點在和(hé)酒精相關的行(xíng)為(wèi)中的具體作(zuò)用還懸而未決。為(wèi)了(le)研究這(zhè)些問(wèn)題，作(zuò)者從(cóng)長(cháng)期酗酒患者的大腦組織入手，來研究膜蛋白的表達水平是如(rú)何在酗酒患者的大腦中變化的。理解這(zhè)些分子水平上(shàng)的變化有可(kě)能(néng)能(néng)為(wèi)酒精為(wèi)什麽能(néng)在動物(wù)身上(shàng)引起多種行(xíng)為(wèi)反應的分子機制提供一(yī)些答(dá)案。因此，作(zuò)者首先從(cóng) NIH 的人(rén)類腦庫獲得 6 個正常人(rén)和(hé) 6 個酗酒者的大腦海(hǎi)馬組織，并通(tōng)過對人(rén)類大腦海(hǎi)馬膜蛋白進行(xíng)分離純化和(hé)定量質譜學分析，找到一(yī)系列在表達水平上(shàng)有變化的膜蛋白。進一(yī)步分析發現，新的跨膜蛋白 TMEM132B 在長(cháng)期酗酒患者的海(hǎi)馬中表達明(míng)顯減低(dī)。通(tōng)過構建 GST-TMEM132B 融合蛋白進行(xíng) GST-Pulldown 在小鼠海(hǎi)馬勻漿液中反向尋找其結合蛋白，并通(tōng)過質譜學分析發現其能(néng)夠結合 GABAA 受體亞基系列家族成員(yuán)。研究人(rén)員(yuán)進一(yī)步在小鼠腦組織中進行(xíng)免疫共沉澱實驗中發現 TMEM132B 能(néng)夠與 GABAA 受體結合。另外(wài)，在小鼠中遺傳敲除 TMEM132B 會導緻 GABAA 受體在突觸後膜表達量下(xià)降并降低(dī) GABA 能(néng)抑制性突觸傳遞。這(zhè)些結果表明(míng) TMEM132B 蛋白與 GABAA 受體相互作(zuò)用并調節 GABAA 受體在突觸上(shàng)的含量。
TMEM132B 調節酒精在 GABAA 受體上(shàng)的正向變構效應
在此之前有許多研究已經顯示酒精是 GABAA 受體的正向變構調節劑 2,13-15。因此，作(zuò)者研究了(le) TMEM132B 是否能(néng)調節酒精在 GABAA 受體上(shàng)的作(zuò)用。研究團隊首先在表達 GABAA 受體和(hé) TMEM132B 的 HEK293T 細胞中測量了(le) GABA 誘導的全細胞電流，發現雖然酒精（50 mM）在隻表達 GABAA 受體的細胞中增強了(le)非飽和(hé)濃度 GABA（10 uM）誘導的全細胞電流，但(dàn)在表達 GABAA 受體和(hé) TMEM132B 的細胞中，全細胞電流的增強幅度更大（圖 1A）。該結果表明(míng) TMEM132B 能(néng)增強異源細胞中酒精對 GABAA 受體的正向變構效應。值得注意的是 GABAA 受體的其他(tā)結合蛋白，包括 Shisa7、gephyrin、LHFPL4 和(hé) Neuroligin2，并沒有增強酒精對 GABAA 受體的正向變構效應，這(zhè)表明(míng) TMEM132B 在調節酒精對 GABAA 受體的正向變構效應方面具有獨特性。另外(wài)，在 HEK293T 細胞中的劑量-反應曲線實驗顯示，TMEM132B 顯著增強了(le)酒精在不同濃度下(xià)對 GABAA 受體的正向變構效應（圖 1B）。然而，TMEM132B 并沒有改變酒精對調節 GABA 誘導電流的 EC50（圖 1B）。因此，TMEM132B 增加了(le)酒精增強 GABAA 受體電流的功效 (efficacy)，但(dàn)不改變其效力（potency, EC50）。另外(wài)，在澳大利亞昆士蘭大學 Angelo Keramidas 研究員(yuán)和(hé)陸偉實驗室博士後彭世笑的共同協助下(xià)，研究人(rén)員(yuán)進一(yī)步證明(míng)了(le) TMEM132B 結合 GABAA 受體以後能(néng)引起 GABAA 受體離子通(tōng)道(dào)的關閉減慢(màn)。這(zhè)一(yī)結果表明(míng) TMEM132B 結合 GABAA 受體除了(le)能(néng)增強酒精在 GABAA 受體上(shàng)的正向變構效應，也能(néng)調控 GABAA 受體離子通(tōng)道(dào)的動力學。
圖 1. TMEM132B 增強了(le)酒精在 GABAA 受體上(shàng)的正向變構效應. (A) 左圖：顯示了(le) HEK293T 細胞中 GABA 或 GABA+酒精誘導的全細胞電流。右圖：柱狀圖顯示 TMEM132B 增強了(le)酒精在 α2β3γ2 GABAA 受體上(shàng)的正向變構效應。(B) 左圖: 顯示了(le)在表達 α2β3γ2 GABAA 受體或 α2β3γ2 GABAA 受體與 TMEM132B 的 HEK293T 細胞中，由 GABA 或 GABA+酒精誘導的全細胞電流。右圖：劑量反應曲線顯示，TMEM132B 顯著提高了(le)酒精增強 GABAA 受體電流的功效 (efficacy)，但(dàn)不影響其效力（potency, EC50）
基因敲除 TMEM132B 導緻小鼠飲酒增多并降低(dī)酒精的鎮定與催眠效應
接下(xià)來，研究人(rén)員(yuán)對 TMEM132B 基因敲除小鼠進行(xíng)系列的和(hé)酒精相關的行(xíng)為(wèi)學分析。在十字迷宮實驗中，當給小鼠注射低(dī)劑量酒精（1.5 g/kg）時(shí)，相比野生型小鼠，敲除 TMEM132B 的小鼠在十字架開(kāi)放區(qū)活動次數(shù)明(míng)顯減少(shǎo)（圖 2A）。這(zhè)說明(míng)基因敲除 TMEM132B 能(néng)降低(dī)低(dī)劑量酒精的抗焦慮效應。當注射高劑量的酒精（4 g/kg）時(shí)，研究人(rén)員(yuán)發現敲除 TMEM132B 的小鼠更不容易進入鎮定與催眠的狀态。比如(rú)，在翻正反射喪失（loss of righting reflex, LORR）行(xíng)為(wèi)實驗中，對比野生型小鼠，TMEM132B 敲除小鼠在注射等劑量的酒精（4 g/kg）後，其達到失去知覺狀态時(shí)所需的時(shí)間(jiān)更久，另外(wài)從(cóng)失去知覺中蘇醒過來所用時(shí)間(jiān)更短（圖 2B）。這(zhè)些結果表明(míng)，敲除 TMEM132B 以後會減弱酒精在神經系統中的作(zuò)用，降低(dī)酒精的鎮定和(hé)催眠的功效。另外(wài)，研究人(rén)員(yuán)也設計了(le)長(cháng)期飲酒和(hé)酗酒實驗，并觀察到敲除 TMEM132B 的小鼠在訓練飲酒一(yī)周左右，飲酒量明(míng)顯增加，超過了(le)同窩野生型對照小鼠。最後，研究人(rén)員(yuán)在小鼠酗酒實驗中發現敲除 TMEM132B 的小鼠有更嚴重的酗酒行(xíng)為(wèi)。
圖 2. TMEM132B KO 減弱了(le)酒精的抗焦慮和(hé)催眠作(zuò)用。(A) 上(shàng)圖：高架十字迷宮（EPM）中小鼠在臂中的代表性累計運動圖。低(dī)劑量酒精（1.5 g/kg）增加了(le) WT 小鼠在 EPM 開(kāi)放臂中的停留時(shí)間(jiān)和(hé)進入開(kāi)放臂的次數(shù)（下(xià)圖），但(dàn)對 KO 小鼠無效。(B) 餅圖顯示高劑量酒精（4.0 g/kg）導緻所有 WT 小鼠出現 LORR，而僅約 62% 的 KO 小鼠出現 LORR（上(shàng)圖）。另外(wài)，在出現 LORR 的 TMEM132B KO 小鼠裏，注射酒精（4.0 g/kg）引起的 LORR 潛伏期顯著延長(cháng)了(le)， 同時(shí) LORR 持續時(shí)間(jiān)也顯著縮短了(le)（下(xià)圖)
目前，雖然酒精能(néng)結合并調控大腦中多種離子通(tōng)道(dào)和(hé)受體，但(dàn)科學界對酒精是怎麽引起各種行(xíng)為(wèi)反應的分子機制的了(le)解并不深入。當前的研究結果表明(míng)，一(yī)個新的跨膜蛋白 TMEM132B 能(néng)調節酒精在 GABAA 受體上(shàng)的功能(néng)，并能(néng)抑制小鼠的飲酒行(xíng)為(wèi)和(hé)增強酒精的降焦慮，鎮定和(hé)催眠功能(néng)。當然，這(zhè)項研究也不排除谷氨酸 NMDA 受體或其它受體和(hé)離子通(tōng)道(dào)在調節酒精的行(xíng)為(wèi)效應上(shàng)的重要(yào)功能(néng)。另外(wài)，酒精的行(xíng)為(wèi)效應也與多巴胺神經元的活性有關，但(dàn)是酒精如(rú)何調控多巴胺神經元釋放多巴胺還需要(yào)深入研究。
美國(guó)國(guó)立衛生研究院國(guó)家神經疾病與中風(fēng)研究所陸偉研究員(yuán)是本文的通(tōng)訊作(zuò)者，課題組博士後王國(guó)昊，彭世笑，吳坤偉，Miriam Reyes Mendez，韓文妍，David Castellano， 實驗室管理員(yuán)田慶君老(lǎo)師(shī)，澳大利亞昆士蘭大學 Angelo Keramidas 研究員(yuán)，國(guó)家神經疾病與中風(fēng)研究所蛋白質譜學中心的 Yan Li 博士，國(guó)家眼科研究所的 Lijin Dong 博士，NINDS& NICHD 動物(wù)中心員(yuán)工(gōng) Daniel Abebe 等，在該研究中都(dōu)做(zuò)了(le)重要(yào)貢獻。